quinta-feira, 15 de outubro de 2020

MICROBIOLOGIA FORENSE - Parte II

Microbioma humano na identificação forense

O microbioma humano é composto por trilhões de células de microrganimos e, por causa disso, também pode ser importante para análise forense. Quando pensamos em identificação forense, sempre lembramos da impressão digital e do DNA, não é mesmo? São ferramentas bem conhecidas e estabelecidas, difundidas em livros, filmes e séries. Mas e se eu disser a você que existe uma ferramenta biológica com potencial ainda maior e melhor para a identificação de indivíduos?

Sabe-se que o microbioma da pele é muito variável e específico para cada indivíduo, pois, dentre as bactérias que podem fazer parte dele, compartilhamos apenas 13% das espécies com outras pessoas. Ou seja, temos 87% de bactérias diferentes na nossa pele!

É fácil imaginar que, ao tocar um objeto, as bactérias presentes em nossas mãos são transferidas para o referido objeto. Mas o que não sabíamos é que essas podem ficar viáveis por vários dias e que podem ser recuperadas e comparadas com a microbiota das mãos de um suspeito de um crime. As bactérias são tão específicas para cada indivíduo que podem ser usadas com mais acuidade do que a impressão digital!

Um estudo de Fierer e colaboradores (2010) analisou a microbiota das mãos de 3 indivíduos e também as bactérias presentes em teclados de computadores pertencentes a eles. Por meio de sequenciamento do gene 16S rRNA, concluíram que existiam 3 grupos de bactérias com grande similaridade entre si e cada grupo era composto por uma dupla teclado/dono do teclado. Comparando essas bactérias com outras isoladas de 250 indivíduos que não tinham tido contato com os teclados, percebeu-se que as diferenças genéticas entre elas eram muito grandes. Isso mostrou que é possível usar a microbiota de um indivíduo como uma “assinatura” bacteriana específica. Este tipo de abordagem pode ser empregado quando não há vestígios de sangue ou sêmen na cena do crime, por exemplo, ou quando os materiais são muito texturizados para que se possa recuperar impressões digitais.

 

Micologia Forense

Até pouco tempo atrás, os fungos eram usados como evidências de crimes apenas em casos de envenenamentos por cogumelos. Hoje sabemos que os fungos podem ser importantes aliados na elucidação de crimes, especialmente em relação à determinação do intervalo post mortem, à determinação do local da morte e do culpado por um crime, e até em casos de negligência, especialmente envolvendo crianças e idosos.

Entretanto, por ser uma área relativamente nova, ainda há poucos trabalhos publicados e o número de especialistas é pequeno, o que dificulta seu uso e desenvolvimento.

Por produzirem esporos, os fungos podem fazer parte das investigações palinológicas, que utilizam pólen e pequenos fragmentos para atribuir uma relação entre uma vítima ou um local com um suspeito.

Revisões sobre o assunto, publicadas por Hawksworth e Wiltshire em 2011 e 2015, trazem vários exemplos do uso de esporos fúngicos na elucidação de crimes. Os autores descrevem casos em que culpados foram condenados após a análise palinológica das suas roupas, calçados e carros.

A determinação do intervalo post mortem é um dos maiores desafios da ciência forense. As fases da decomposição cadavérica podem durar mais ou menos tempo dependendo da estação do ano, da temperatura e umidade do local onde o cadáver foi encontrado. Além dos dados de entomologia forense, que são fundamentais para estabelecer esse período, por meio da análise da fauna entomológica cadavérica, os fungos podem ser importantes aliados. Eles apresentam características próprias de crescimento em determinados ambientes, portanto podem ser usados para determinar há quanto tempo um corpo encontra-se em determinado local. Imagine que um corpo foi encontrado e na superfície dele é possível observar o crescimento de colônias fúngicas. Após o isolamento dos fungos, é possível reproduzir em laboratório as condições ambientais em que o corpo foi encontrado e estimar o tempo de crescimento do fungo isolado. Com isso, pode-se inferir o intervalo post mortem.

Um estudo brasileiro, realizado por pesquisadores na Universidade Federal do Ceará (SIDRIM e colaboradores, 2015), analisou os fungos que cresciam em cadáveres, em 3 estágios de decomposição, e demonstrou que estes podem ser encontrados principalmente na fase gasosa de decomposição. Ainda foi determinado que fungos filamentosos podem ser isolados das roupas, dos ossos e do solo próximo aos corpos, enquanto leveduras foram encontradas nos caixões. A maior parte dos fungos encontrados são aqueles que habitam o solo e estão presentes no ar, como Aspergillus sp., Penicillium sp. e Mucor sp., enquanto as leveduras pertencem ao gênero Candida.

As potencialidades do uso de fungos como ferramentas forenses são inúmeras, abrindo um amplo leque para novas pesquisas na área.

 

Referências

 

HAWKSWORHT, D.; WILTSHIRE, P.E.J. Forensic mycology: the use of fungi in criminal investigations. Forensic Science International, 206, 1-11, 2011. https://www.researchgate.net/publication/45199583_Forensic_mycology_the_use_of_fungi_in_criminal_investigations Acesso em 08-10-2020 Acesso em 08-10-2020.

 

HAWKSWORHT, D.; WILTSHIRE, P.E.J. Forensic mycology: current perspectives. Research and Reports in Forensic Medical Sciences, 2015. https://www.researchgate.net/publication/286481964_Forensic_mycology_current_perspectives Acesso em 08-10-2020.

SIDRIM et al. Fungal microbiota dynamics as a post-mortem investigation tool: focus on Aspergillus, Penicillium and Candida species. Journal of Applied Microbiology, 2015. https://sfamjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/j.1365-2672.2009.04573.x  Acesso em 08-10-2020.

 

quinta-feira, 8 de outubro de 2020

MICROBIOLOGIA FORENSE - Parte I

Bioterrorismo e biocrime

O instinto de justiça é inerente ao ser humano. Desde pequenos delitos até aqueles que envolvem perdas de vidas humanas, nosso intuito é sempre procurar os culpados e fazer com que sejam punidos. Mas a ideia de punição está atrelada à culpa. Podemos julgar e condenar um indivíduo, atribuindo-lhe a culpa por algum ato criminoso? E se nosso julgamento for falho e um inocente responder por um crime que não cometeu? Para garantir que isso não aconteça, a Ciência Forense alia conhecimentos de diversas áreas para produção de dados robustos que corroborem hipóteses e ofereçam subsídios para a condenação dos reais culpados de um crime.

A Ciência Forense é uma área da investigação criminal que, por meio de técnicas precisas, dá suporte às investigações criminais. Ela tem como foco principal excluir um suspeito envolvido ou não em um crime e, com isso, livrar um inocente por algo que não cometeu. Aliando química, biologia, física, matemática, antropologia e outras tantas áreas, é capaz de apurar a verdade sobre os atos cometidos pelo suspeito.

Os primeiros relatos de ciência forense datam do século VII, na China, em que Ti Yen Chieh se tornou célebre por usar lógica e provas forenses na resolução de crimes. Ainda na China, no século XII, um livro detalhava os sinais de afogamento e estrangulamento e de que forma as feridas poderiam revelar o tipo de arma utilizada no crime. No século XVI, médicos europeus, como Ambroise Paré, passaram a estudar as circunstâncias da morte e os efeitos da morte violenta em órgãos internos. Os médicos Fortunato Fidelis e Paolo Zacchia estudaram as mudanças ocorridas no corpo em decorrência de enfermidades. François Immanuele Fodéré publicou, no final do século XVII, o livro “Um tratado sobre medicina forense e saúde pública”, enquanto Johann Peter Frank publicou “O sistema completo de medicina da polícia”.

No século XVII a ciência forense já era ensinada nas universidades da Europa. Thomas Joseph Gall criou a pseudociência chamada Frenologia, em que atribuía características do caráter do indivíduo à forma do seu crânio. Por motivos óbvios hoje, essa prática caiu em desuso. Entretanto, serviu como base para a elaboração dos retratos falados, baseados em partes do rosto, para identificação de suspeitos.

A ciência forense lança mão de uma série de áreas distintas para auxiliar na resolução de complexos quebra-cabeças. Na biologia, o uso de análises de sequências de DNA é fundamental para identificação de suspeitos e vítimas. Um dos melhores exemplos de uso da biologia é a entomologia forense, que pode ser empregada na determinação do intervalo post mortem, por meio da análise dos insetos que colonizam o cadáver; na elucidação do local da morte; casos de abuso e maus-tratos, bem como casos de pragas urbanas usadas propositalmente.

Uma área da biologia relativamente recente é a Microbiologia Forense. Seu objetivo é usar a análise microbiológica para excluir, associar ou atribuir a culpa por um crime. Inclui uma gama de organismos: vírus, bactérias, fungos, parasitos, reservatórios de doenças infecciosas e ainda, toxinas bacterianas e fúngicas.

A microbiologia forense teve destaque quando ocorreram os casos de Antraz nos EUA, por ocasião dos eventos de 11 de setembro de 2001. Como o antraz é causado por uma bactéria, o envio de esporos pelo correio para diferentes pessoas foi caracterizado como bioterrorismo.

Mas quando essa área teve início realmente?

Na Bíblia, quando Deus pede ao faraó para libertar os escravos israelitas e quando ele não o faz, envia 10 pragas ao Egito. Na Roma antiga, eram jogadas carniças nos poços para contaminar os reservatórios de água dos inimigos. No século XIV, durante a epidemia de peste bubônica na Ucrânia, os corpos das vítimas eram lançados em catapultas, sendo usados como armas. O Japão, durante a Segunda Guerra Mundial, lançou sobre a China, por meio de aviões, pulgas criadas em laboratórios, contaminadas com Yersinia pestis.

Em 1984, seguidores de Baghwan Sri Rajneesh tentaram afetar a eleição local em Dalles, Oregon, EUA, ao contaminar recipientes de saladas em restaurantes da região com Salmonella tiphymurium, e 751 pessoas tiveram infecção alimentar. Em 1993, o culto Aum Shinrikyo tentou disseminar antraz em Tókio, do telhado de um prédio. Em 1996, em Dallas, Texas, EUA, 12 pessoas que trabalhavam em um laboratório do St. Paul Medical Center tiveram diarreia aguda severa. Amostras de Shigella dysinteriae tipo 2 foram isoladas das fezes dos doentes e descobriu-se que um técnico do laboratório havia contaminado propositalmente os alimentos consumidos pelas vítimas. Em 2001, na Alemanha, um surto de E. coli enteroagregativa associado aos brotos de feijão, afetou 2400 pessoas e causou 24 mortes. 

Além destes exemplos, podemos citar também aqueles que envolvem toxinas bacterianas e fúngicas. No século VI, assírios contaminavam a água com ergot, uma toxina produzida pelo fungo Claviceps purpúrea. Depois da Segunda Guerra Mundial, na Rússia, as farinhas foram contaminadas com o fungo Fusarium, e o pão produzido causava doenças nos civis. Existem relatos também de toxinas fúngicas sendo liberadas na forma de “chuva amarela” na China e no Afeganistão, afetando mais de 10 mil pessoas.

Agricultura e pecuária também podem ser impactadas por ataques biológicos. Em 1845 e 1846 a ferrugem da batata na Irlanda foi responsável pela fome e, em consequência, morte de milhões de pessoas. Recentemente, a imprensa vem noticiando o recebimento de sementes oriundas de países da Ásia, por pessoas de vários locais do mundo, inclusive do Brasil. Ainda não se sabe quais são as plantas nem a motivação dos envios, mas é preciso investigar. Plantas exóticas podem se tornar pragas agrícolas, competir com as plantas nativas e dizimar nossas culturas. Sementes contaminadas com patógenos vegetais, como fungos e bactérias, podem levar à sua disseminação e prejudicar a produção agrícola mundial.

Riscos biológicos e biovigilância

Os riscos biológicos envolvem a medicina, a saúde pública e a lei e podem ser descritos como: surgimento natural de um microrganismo (SARS-CoV-2); liberação acidental de um patógeno; biocrime; bioterrorismo; e guerra biológica. A partir da descoberta de um risco biológico, a microbiologia forense visa identificar o microrganismo, padronizar e validar as evidências legais. Cabe à Organização Mundial da Saúde realizar a biovigilância, e esse cuidado é importante, pois doenças com potencial pandêmico podem atingir o mundo em horas ou dias, principalmente disseminadas pelas viagens. Veja como exemplo a SARS (2002 e 2003), H1N1, H1N5 e H7N9 (2009), MERS (2012) e a Covid-19 (2020).

A OMS faz o monitoramento das ameaças à saúde, especialmente na interface do ecossistema homem-animal, levando em conta zoonoses emergentes, zoonoses já conhecidas, resistência antimicrobiana e zoonoses veiculadas por alimentos. O objetivo é reduzir surtos, sejam eles naturais, acidentais ou propositais, com resposta rápida usando coordenação multissetorial e internacional.

Bioterrorismo

O bioterrorismo envolve a ameaça ou uso de agentes biológicos por indivíduos ou grupos motivados por objetivos políticos, religiosos, ecológicos ou ideológicos e normalmente criminosos, com intuito de extorsão, vingança, desejo de aterrorizar vítimas específicas e assassinato.

O caso mais conhecido de bioterrorismo é o Amerithrax. Em 2001, entre 4 de outubro e 20 de novembro, 22 pessoas contraíram antraz e 5 morreram. A investigação levou 9 anos e levou ao desenvolvimento da microbiologia forense.

A bactéria Bacillus anthracis é capaz de produzir esporos, os quais são extremamente resistentes a condições ambientais adversas, podendo ficar latentes por muitos anos. Isso faz com que estas bactérias sejam muito estáveis geneticamente, quase não sofrendo alterações ao longo do tempo. A estabilidade genética é um complicador, pois dificulta traçar a origem das linhagens, uma vez que todas são muito similares.

Não havia uma metodologia estabelecida para a análise genética das linhagens. Inicialmente analisou-se o comprimento de regiões repetitivas em tandem, visando estabelecer as diferenças genéticas, mas essas não foram informativas. Partiu-se então para o sequenciamento do genoma total dos isolados. A partir destes resultados, descobriu-se que, embora todos pertencessem à linhagem Ames de Bacillus anthracis, alguns tinham inserções e duplicações no material genético, especialmente relacionadas com características de esporulação. Dentre os 29 laboratórios investigados, públicos e privados, apenas um continha a linhagem com as mutações. Assim, sua origem ficou determinada, e concluiu-se que as alterações genéticas haviam surgido ao acaso, devidas aos sucessivos repiques da linhagem selvagem em laboratório.

Mas como encontrar o culpado?

O suspeito deveria ter acesso ao laboratório e conhecimento científico suficiente para produzir os esporos em grande quantidade. Além disso, deveria ter noção do impacto de seus atos e motivação para o crime. Pensando desta forma, os próprios pesquisadores que auxiliavam na investigação tornaram-se suspeitos!

O Dr. Bruce Ivins se encaixava no perfil elaborado pelo FBI. Ele tinha acesso irrestrito ao laboratório, havia trabalhado à noite e no final de semana anterior ao envio das cartas, tinha histórico de problemas psicológicos e se encontrava sob grande pressão no trabalho. Antes do final da investigação, o Dr. Ivins cometeu suicídio, o que evidenciou ainda mais o seu provável envolvimento com o crime.

Este caso teve grande repercussão na mídia, o que gerou bastante confusão, atrapalhando as investigações. As publicações na época foram limitadas e existem até hoje dados não publicados.

Biocrime

Um biocrime se caracteriza pelo uso de um microrganismo na execução de um crime, com o intuito de prejudicar, amedrontar e até mesmo matar um ou mais indivíduos. Um exemplo importante de biocrime foi o caso da transmissão proposital de HIV-1 por um médico gastroenterologista de Laffayete, Louisiania, nos EUA. Ele contaminou a ex-namorada com sangue de um paciente HIV positivo, durante uma discussão. Foi a primeira vez em que dados de análise filogenética foram aceitos como evidências em uma investigação criminal.

Foram analisados clones do vírus isolados da vítima e do paciente HIV positivo, bem como de HIVs de indivíduos controle, da mesma região. A análise dos genes env (envelope) e gp120 (glicoproteína) indicaram que o vírus sofre muitas mutações e é muito heterogêneo. Entretanto, os vírus isolados da vítima e do paciente podem ser agrupados, têm origem comum, enquanto os vírus dos controles são muito diferentes. Ou seja, a chance de que a vítima tivesse sido infectada por outro vírus, que não aquele que lhe fora injetado propositalmente, era ínfima. Estas evidências foram aceitas pelo tribunal e o médico foi condenado por tentativa de homicídio.

A microbiologia forense pode ser muito útil na elucidação de crimes. Nos próximos posts serão abordados o uso do microbioma humano na identificação de indivíduos e a micologia forense, na determinação de intervalo post mortem e identificação de culpados de crimes.

Referências

Amerithrax. https://www.fbi.gov/history/famous-cases/amerithrax-or-anthrax-investigation. Acesso em 08/10/2020.

Amerithrax Investigative Summary. 

https://www.nytimes.com/interactive/projects/documents/amerithrax-investigation-report. Acesso em 08/10/2020.

METTZKER et al. Molecular evidence of HIV-I transmission in a criminal case. PNAS, 99 (22),14292-14297, 2002.  https://www.pnas.org/content/99/22/14292 Acesso em 08-10-2020.

RASKO et al. Bacillus anthracis comparative genome analysis in support of the Amerithrax investigation. PNAS, 108 (12), 5027-5032, 2011. https://www.pnas.org/content/108/12/5027. Acesso em 08/10/2020.